fa تشخیص هیستیدین اساسی در عمل کاتالیتیکی آنزیم فسفاتیدات فسفوهیدرولاز غشایی کبد موش صحرایی نر عمومى General پژوهشي Research <p style="DIRECTION: rtl" align="justify"><strong>سابقه و هدف:</strong> آنزیم فسفاتیدات فسفوهیدرولاز (PAP) باعث تبدیل اسید فسفاتیدیک به دی‌آسیل گلیسرول و فسفات معدنی (Pi) می شود. دو فرم مختلف از آنزیم PAP در سلولهای کبدی موش صحرایی گزارش شده است، یکی PAP1 که در متابولیسم فسفولیپیدها و گلیسرولیپیدها و دیگری  PAP2که در پدیده Signal transduction نقش دارد. PAP2 در موش صحرایی دارای دو ایزوفرم PAP2a و PAP2b  می باشد. در این مطالعه وجود هیستیدین اساسی در آنزیم PAP2b مورد بررسی قرار گرفت.<br><strong>مواد و روش ها:</strong> با استفاده از n- اکتیل گلوکوزید، غشای سلول های کبدی موش صحرایی حل گردید و PAP2b طی چندین مرحله ی کروماتوگرافی تخلیص گردید. ثابت‌های کینتیکی بــر اساس مدل کینتیک رقت سطحی تعیین گردیدند. جهت تعیین خلوص، تعداد و وزن زیرواحدهای آنزیمی از روش الکتروفورز ناپیوسته در حضور SDS با ژل پلی اکریل آمید 10 درصد استفاده گردید. تعداد مول هیستیدین موجود در یک مول آنزیم با استفاده از مشتق –N کربتوکسی هیستیدین محاسبه شد.<br><strong>نتایج:</strong> PAP2b تخلیص شده فعالیت ویژه‌ای معادل mU/mg protein7350 داشت. الکتروفورز PAP2b تخلیص شده در حضور SDS یک نوار با وزن مولکولی 8/33 کیلودالتون نشان داد. مطالعات غیرفعال سازی آنزیم به وسیله معرف دی‌اتیل ‌پیرو کربنات شواهدی بر ضرورت وجود هیستیدین اساسی برای فعالیت آنزیم مهیا کرد. تعداد مول هیستیدین تعدیل شده به ازای هر مول آنزیم 6 عدد بود. <br><strong>نتیجه گیری</strong>: مهار آنزیم توسط دی‌اتیل پیرو کربنات نسبت به اسید فسفاتیدیک رقابتی بود و نشان از حضور هیستیدین در مکان فعال آنزیم داشت. احتمالا واکنش کاتالیتیکی PAP2b  نیز می‌بایستی همانند سایر اعضای خانواده‌اش از طریق تشکیل واسطه ی فسفوهیستیدنی انجام گیرد.</p> <p><strong>Background</strong>: Phosphatidate phosphohydrolase enzyme (PAP) catalyzes the transformation of phosphatidic acid to P_i and diacylglycerol. Two different forms of PAP have been reported in rat hepatocytes PAP₁ which participates in the synthesis of phospholipids and triacylglycerols, and PAP₂ which involved in lipid signaling transduction.<strong> </strong>PAP₂ has two isoforms namely PAP_2a and PAP_2b. In this study the role of essential<strong> </strong>histidine residues<strong> </strong>in PAP_2bwas assessed.</p><p><strong>Material and Methods: </strong>The rat liver plasma membrane was solved using n-octyle glucoside and PAP_2bpurified during several chromatography steps. The kinetics parameters were assessed based on surface kinetic dilution model. Discontinuous gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed on purified enzyme in order to evaluate its purity and to measure the molecular weight of the enzyme subunit in gel 10%. The number of mol histidine residues modified per mol enzyme was determined based on the formation of N-carbetoxy histidine. </p><p><strong>Results:</strong> The specific activity of purified enzyme was 7350mU/mg protein. PAP_2b showed only a single band on SDS-PAGE with a mass weight of 33.8 kDa by electrophoresis. The PAP_2b was inactivated by DEPC. The inhibition was competitive with respect to phosphatidate and the maximum 6 moles of histidine residues were modified per mole PAP_2b.</p><p><strong>Conclusion:</strong> The data have shown that the incubation of PAP_2b by DEPC plus phosphatidate can prevent the inhibitory effect of DEPC on enzyme activity. Our findings also revealed the role of histidine in the active site of PAP_2b .This enzyme is likely to have a similar hydrolysis catalytic mechanism as its super family through a phosphohistidine intermediate. </p> فسفاتیدات فسفوهیدرولاز، هیستیدین، دی‌اتیل پیروکربنات، اسید فسفاتیدیک Diethylpyrocarbonate, Histidine, Phosphatidic acid, Phosphatidate phosphohydrolase 1 8 http://feyz.kaums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-622&slc_lang=fa&sid=1 Esfandiar Heidarian اسفندیار حیدریان heidarian46@ yahoo.com 290031947532846002618 290031947532846002618 Yes Bahram Haghighi بهرام حقیقی 290031947532846002619 290031947532846002619 No