fa رنگ آمیزی معکوس: روشی مؤثر برای تخلیص پروتئین HIV-1 Nef در سیستم بیان پروکاریوتی medicine, paraclinic medicine, paraclinic پژوهشي Research <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><strong>سابقه و هدف:</strong> پروتئین <span dir="LTR">Nef</span>، یکی از پروتئین&shy; های تنظیمی ویروس <span dir="LTR">HIV</span>، دارای اپی&shy;توپ&shy; های حفاظت شده متعددی است که در افراد آلوده به ایدز پاسخ&shy; های ایمنی قدرتمندی علیه آن ها مشاهده شده است. بنابراین، پروتئین <span dir="LTR">Nef</span> کاندید مناسبی برای تولید واکسن می&shy; باشد. هدف این پژوهش کلونینگ و بیان پروتئین <span dir="LTR">Nef</span> در سیستم بیان پروکاریوتی و تخلیص آن به روش رنگ&shy;آمیزی معکوس می&shy; باشد.</p> <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><strong>مواد و روش&shy; ها:</strong> توالی کدکننده پروتئین <span dir="LTR">Nef</span> از وکتور <span dir="LTR">pUC19</span> توسط <span dir="LTR">PCR</span> تکثیر شد و الحاق آن به داخل وکتور بیانی <span dir="LTR">pGEX6p2</span> انجام شد. این سازه طی فرایند ترانسفورماسیون به سویه باکتری <em><span dir="LTR">E.coli BL21</span></em> منتقل شده و القای بیان پروتئین با استفاده از آنتی&shy;رپرسور <span dir="LTR">IPTG</span> صورت گرفت. تأیید بیان پروتئین با استفاده از آنالیز <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> و وسترن بلات توسط آنتی&shy; بادی ضد <span dir="LTR">Nef</span> بررسی گردید. تخلیص پروتئین با استفاده از تکنیک رنگ آمیزی معکوس از روی ژل انجام شد.</p> <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><strong>نتایج:</strong> نتایج آنالیز <span dir="LTR">PCR</span> و هضم آنزیمی وجود باند واضح حدود 648 جفت باز را روی ژل آگاروز تأیید کرد که نشان&shy;گر کلونینگ صحیح ژن <span dir="LTR">Nef</span> در وکتور بیان پروکاریوتی <span dir="LTR">pGEX6p2</span> می&shy; باشد. هم&shy; چنین، وجود باند حدود 50 کیلودالتون نشان&shy;گر بیان پروتئین <span dir="LTR">Nef</span> توسط آنتی&shy;بادی منوکلونال ضد <span dir="LTR">Nef</span> در آنالیز وسترن بلات تأیید شد. در نهایت، باند خالص شده پروتئین توسط تکنیک رنگ&shy;آمیزی معکوس به &shy;دست آورده شد.</p> <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><strong>نتیجه&shy; گیری:</strong> پروتئین نوترکیب <span dir="LTR">Nef</span> بیان شده در میزبان <em><span dir="LTR">E. coli</span></em> با بازده مناسب توسط روش رنگ&shy; آمیزی معکوس تخلیص شد. پروتئین <span dir="LTR">Nef</span> در آینده به&shy; عنوان یک آنتی&shy;ژن برای طراحی واکسن پروتئینی در مقابل عفونت ویروس <span dir="LTR">HIV</span> استفاده خواهد شد.</p> <p style="text-align: justify;"><strong>Background:</strong> Nef protein is one of the HIV regulatory proteins. This protein has various conserved epitopes inducing the efficient immune responses in HIV-1 infected individuals. Thus, Nef protein has been proposed as a suitable candidate for vaccine design. In current study, our goal was the cloning and expression of Nef protein in prokaryotic expression system and its purification using the reverse staining method.&nbsp;</p> <p style="text-align: justify;"><strong>Materials and Methods:</strong> The coding sequence of Nef protein was amplified from pUC19-<em>nef</em> vector by PCR. Then, <em>nef </em>gene was inserted into the pGEX6p2 expression vector. This construct was transformed into the <em>E.coli</em> BL21 <em>E.coli</em> strain and subsequently protein expression was induced by IPTG anti-repressor. The protein expression was confirmed by SDS-PAGE and Western blot using anti-Nef antibody. Protein purification was performed by reverse staining method.</p> <p style="text-align: justify;"><strong>Results:</strong> The PCR and digestion analysis showed a clear band of 648 bp in agarose gel indicating the correct cloning of HIV-<em>nef</em> in pGEX6p2 expression vector. In addition, the detection of a clear 50 kDa band &nbsp;&nbsp;in Western blotting using Anti-Nef antibody suggests the Nef protein expression induced by IPTG. Finally, the purified protein was obtained by reverse staining method.</p> <p style="text-align: justify;"><strong>Conclusion:</strong> The recombinant Nef protein expressed in <em>E.coli</em> was purified by reverse staining method. The Nef protein has the potential of antigenicity for vaccine designing against HIV infections.</p> <p></p> ویروس HIV, Nef, کلونینگ, بیان و تخلیص, رنگ آمیزی معکوس, اشریشیاکلی HIV virus, Nef, Cloning, Expression and purification, Reverse staining, E. coli 420 426 http://feyz.kaums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-176-1299&slc_lang=fa&sid=1 Behnaz Sadat Jafarzade بهنازسادات جعفرزاده 2900319475328460017896 2900319475328460017896 No Department of Microbiology, Shiraz Branch, Islamic Azad University, Shiraz, I. R. Iran. بخش میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران Seyyed Mehdi Sadat سید مهدی سادات 2900319475328460017897 2900319475328460017897 No Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I. R. Iran. بخش هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران Ramin Yaghobi رامین یعقوبی 2900319475328460017898 2900319475328460017898 No Shiraz Transplant Research Center, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, I. R. Iran. بخش تحقیقات پیوند، دانشگاه علوم پزشکی شیراز ، شیراز، ایران Azam Bolhassani اعظم بوالحسنی azam.bolhassani@yahoo.com 2900319475328460017899 2900319475328460017899 Yes Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I. R. Iran. بخش هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران