TY - JOUR JF - KAUMS JO - Feyz VL - 20 IS - 5 PY - 2016 Y1 - 2016/11/01 TI - Reverse staining: Effective method for purification of HIV-1 Nef protein in prokaryotic expression system TT - رنگ آمیزی معکوس: روشی مؤثر برای تخلیص پروتئین HIV-1 Nef در سیستم بیان پروکاریوتی N2 - سابقه و هدف: پروتئین Nef، یکی از پروتئین­ های تنظیمی ویروس HIV، دارای اپی­توپ­ های حفاظت شده متعددی است که در افراد آلوده به ایدز پاسخ­ های ایمنی قدرتمندی علیه آن ها مشاهده شده است. بنابراین، پروتئین Nef کاندید مناسبی برای تولید واکسن می­ باشد. هدف این پژوهش کلونینگ و بیان پروتئین Nef در سیستم بیان پروکاریوتی و تخلیص آن به روش رنگ­آمیزی معکوس می­ باشد. مواد و روش­ ها: توالی کدکننده پروتئین Nef از وکتور pUC19 توسط PCR تکثیر شد و الحاق آن به داخل وکتور بیانی pGEX6p2 انجام شد. این سازه طی فرایند ترانسفورماسیون به سویه باکتری E.coli BL21 منتقل شده و القای بیان پروتئین با استفاده از آنتی­رپرسور IPTG صورت گرفت. تأیید بیان پروتئین با استفاده از آنالیز SDS-PAGE و وسترن بلات توسط آنتی­ بادی ضد Nef بررسی گردید. تخلیص پروتئین با استفاده از تکنیک رنگ آمیزی معکوس از روی ژل انجام شد. نتایج: نتایج آنالیز PCR و هضم آنزیمی وجود باند واضح حدود 648 جفت باز را روی ژل آگاروز تأیید کرد که نشان­گر کلونینگ صحیح ژن Nef در وکتور بیان پروکاریوتی pGEX6p2 می­ باشد. هم­ چنین، وجود باند حدود 50 کیلودالتون نشان­گر بیان پروتئین Nef توسط آنتی­بادی منوکلونال ضد Nef در آنالیز وسترن بلات تأیید شد. در نهایت، باند خالص شده پروتئین توسط تکنیک رنگ­آمیزی معکوس به ­دست آورده شد. نتیجه­ گیری: پروتئین نوترکیب Nef بیان شده در میزبان E. coli با بازده مناسب توسط روش رنگ­ آمیزی معکوس تخلیص شد. پروتئین Nef در آینده به­ عنوان یک آنتی­ژن برای طراحی واکسن پروتئینی در مقابل عفونت ویروس HIV استفاده خواهد شد. SP - 420 EP - 426 AU - Jafarzade, Behnaz Sadat AU - Sadat, Seyyed Mehdi AU - Yaghobi, Ramin AU - Bolhassani, Azam AD - Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I. R. Iran. KW - HIV virus KW - Nef KW - Cloning KW - Expression and purification KW - Reverse staining KW - E. coli UR - http://feyz.kaums.ac.ir/article-1-3173-fa.html ER -